RNAscope常見問題小貼士 | 掉片、沒信號(hào)以及特殊樣本問題
美國Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司的RNAscope技術(shù)作為新一代的RNA原位雜交技術(shù)，通過其專利的雙Z探針設(shè)計(jì)原理以及信號(hào)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)，可以兼容由于空氣中RNA酶對(duì)于RNA的部分降解導(dǎo)致一定程度的組織RNA缺損，從而達(dá)到對(duì)組織和細(xì)胞內(nèi)的RNA進(jìn)行高效的原位檢測。
在使用RNAscope，Basescope以及miRNAscope對(duì)石蠟樣本，新鮮冰凍和固定冰凍樣本的組織切片進(jìn)行原位雜交的過程中，經(jīng)常會(huì)遇到各種各樣的技術(shù)問題。前三期我們就樣本制備，樣本預(yù)處理的一些注意細(xì)節(jié)，以及問題樣本預(yù)處理調(diào)整方案進(jìn)行了探討，本期繼續(xù)就其他一些客戶常見問題給大家提供一些相關(guān)小貼士。
在解決了樣本制備和預(yù)處理問題后，客戶還會(huì)遇到的一些RNAscope檢測常見問題有：
1 掉片問題
掉片多見于石蠟樣本和固定冰凍樣本。說是多見，并不意味著這是一個(gè)普遍現(xiàn)象，通常按照ACD產(chǎn)品說明書里的樣本制備方法進(jìn)行的樣本制備和其他標(biāo)準(zhǔn)流程操作，掉片現(xiàn)象并不常見。當(dāng)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)掉片現(xiàn)象時(shí)，可以通過以下幾點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整：
01
確保使用高粘附載玻片
與免疫組化不同，ACD的包括RNAscope, Basescope，miRNAscope等的操作流程相對(duì)較長，除前期預(yù)處理的三個(gè)主要步驟，探針雜交2小時(shí)以外，后續(xù)還要根據(jù)檢測試劑盒的不同，有若干步Amp的孵育，直到最后顯色（可見光或者熒光）。所以公司推薦使用高粘附的進(jìn)口載玻片進(jìn)行組織切片的粘附和后續(xù)檢測。具體可選用的載玻片請(qǐng)參見說明書或直接與我公司的技術(shù)人員交流(chinaACDFAS@bio-techne.com)。
02
按照公司推薦的標(biāo)準(zhǔn)流程制備組織樣本
具體的樣本制備方法在前幾期的軟文以及公司產(chǎn)品說明書里都有描述，這里不再贅述。
03
在進(jìn)行貼片時(shí)盡量避免氣泡，適當(dāng)延長烤片時(shí)間
貼片時(shí)，當(dāng)組織切片與載玻片間沒有完全牢固貼合上，則會(huì)降低由于電荷間吸附力下降導(dǎo)致的空隙，在后續(xù)檢測時(shí)，這些不牢固區(qū)域會(huì)導(dǎo)致掉片；石蠟切片建議在60℃烤箱烤1小時(shí)。在脫片的情況下，可以適當(dāng)延長到1個(gè)半小時(shí)。而固定冰凍樣本切片也可以通過增加烤片環(huán)節(jié)增加粘附（時(shí)間可以控制在60℃半小時(shí)）。
04
對(duì)于石蠟切片和固定后冰凍切片，如果遵守上述操作后仍然有掉片問題，可以參考增加以下步驟進(jìn)行操作。
石蠟切片可以在第一步烤片后或者target retrieval之后增加烤片環(huán)節(jié)，降低脫片問題（見上圖）。
固定后冰凍切片可以在上圖的I（-20℃低溫干燥2小時(shí)），II（進(jìn)行后固定），III（增加烤片60℃ 30分鐘環(huán)節(jié)）和IV（去除煮沸步驟但是同時(shí)增加蛋白酶處理）環(huán)節(jié)進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。最終達(dá)到以下右圖效果。
2 靶探針沒有結(jié)果
在遇到這類問題時(shí)，第一時(shí)間需要確認(rèn)樣本的陽性對(duì)照探針（通常包括PPIB或者UBC）和陰性對(duì)照探針(DapB)結(jié)果如何。在眾多此類問題中，有一多半的客戶在確認(rèn)了陽對(duì)和陰對(duì)探針結(jié)果后，都可以很好的回答靶探針沒信號(hào)的問題。即由于樣本本身制備過程中未按照標(biāo)準(zhǔn)流程，固定不充分，導(dǎo)致RNA大幅度降解，故無法檢測到靶探針信號(hào)。
針對(duì)樣本質(zhì)量沒有問題的客戶，則可以與我們的技術(shù)人員聯(lián)系（chinaACDFAS@bio-techne.com），尋求進(jìn)一步的幫助和指導(dǎo)。
3 特殊樣本怎么辦
在常規(guī)的樣本外，經(jīng)常會(huì)遇到客戶使用的是包括類器官，骨骼樣本以及血液等較為特殊的樣本類型，對(duì)于這些種類的樣本，有專門的樣本處理和制備方法，可以幫助完成前期包括固定，脫鈣，包埋等一系列問題，最終放置到載玻片上進(jìn)行常規(guī)RNAscope, Basescope等檢測。相關(guān)制備細(xì)節(jié)可參見本公眾號(hào)之前發(fā)表的軟文，或與我們的技術(shù)部門同事聯(lián)系詢問細(xì)節(jié)。
最后，在開始實(shí)驗(yàn)前注意以下環(huán)節(jié)，將有助于避免實(shí)驗(yàn)中的常見錯(cuò)誤，保證整個(gè)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。
下一期，我們將RNAscope熒光檢測的一些常見問題進(jìn)行探討，與大家一起了解并加深熒光檢測的操作細(xì)節(jié)和關(guān)鍵點(diǎn)。
RNAscope技術(shù)是由Bio-Techne旗下Advanced Cell Diagnostics (ACD)公司研發(fā)的RNA原位雜交產(chǎn)品，在近年來的生物檢測領(lǐng)域發(fā)展迅速。與傳統(tǒng)的RNA原位雜交相比，RNAscope技術(shù)屬于新一代RNA原位雜交技術(shù)，其特異性的雙Z探針設(shè)計(jì)避免了傳統(tǒng)長鏈RNA探針的弊端，配以自身級(jí)聯(lián)放大檢測原理，可以高效敏感地檢測到目標(biāo)RNA。該方法的具體優(yōu)勢(shì)如下：
應(yīng)用廣泛
使用RNAscope技術(shù)，靶點(diǎn)RNA為大于等于300個(gè)堿基的特異序列，即可進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。因而RNAscope技術(shù)可以應(yīng)用于幾乎所有物種，所有組織以及所有基因的檢測。
特異性強(qiáng)
RNAscope獨(dú)特的雙Z（ZZ） 探針設(shè)計(jì)有效的防止了探針的非特異性結(jié)合，同時(shí)降低了背景干擾。由于結(jié)合在非特異性位點(diǎn)的單個(gè)的Z 探針不會(huì)產(chǎn)生完整的信號(hào)放大分子結(jié)合位點(diǎn)，并會(huì)在雜交過程中被洗脫掉，從而防止非特異性信號(hào)的放大，使得探針的信號(hào)具有高度特異性。探針設(shè)計(jì)合成需要2~4周時(shí)間即可完成。
靈敏度高
RNAscope方法檢測每個(gè)RNA 分子時(shí)，只需三對(duì)雙Z（ZZ）探針即可完成雜交和信號(hào)的可視化。
單分子可視化和單細(xì)胞定量
使用RNAscope技術(shù)雜交上三對(duì)及以上雙Z 探針即可在標(biāo)準(zhǔn)的顯微鏡下呈現(xiàn)可觀察到的點(diǎn)狀信號(hào)。ACD公司提供的分析軟件更可以定量每一個(gè)單細(xì)胞內(nèi)RNA 的表達(dá)水平。
兼容降解的RNA
由于RNAscope三對(duì)雙Z探針即可檢測到目標(biāo)RNA，而通常針對(duì)靶點(diǎn)RNA設(shè)計(jì)的探針為20對(duì)雙Z 探針，因而即使目標(biāo)RNA發(fā)生部分降解，仍可以穩(wěn)定有效地檢測到靶點(diǎn)RNA。
檢測結(jié)果穩(wěn)定一致性
RNAscope技術(shù)用到的探針以及所有檢測試劑全部由工業(yè)化合成，且該技術(shù)針對(duì)不同樣本類型（冰凍切片， 石蠟切片，懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞等）已經(jīng)有成熟的實(shí)驗(yàn)操作流程，故使得RNAscope技術(shù)檢測結(jié)果具有穩(wěn)定性和一致性。除了可以在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行手工操作外，該產(chǎn)品也可以在Leica以及羅氏Ventana自動(dòng)平臺(tái)上運(yùn)行，為結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性提供了可靠的依據(jù)。
多通道多靶點(diǎn)同時(shí)檢測
由于RNAscope技術(shù)可以同時(shí)進(jìn)行多通道探針雜交以及信號(hào)放大，故在可見光檢測中可以在同一張切片上同時(shí)檢測兩個(gè)靶點(diǎn)；而在熒光檢測過程中，可以在同一張切片上檢測三個(gè)或三個(gè)以上靶點(diǎn)RNA。
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